支原體PCR檢測培養方法檢測結果

　　支原體PCR檢測培養方法檢測結果
　　
　　支原體PCR檢測直接培養法
　　
　　原理：直接培養支原體于培養基中，觀(guān)察其生長(cháng)及菌落生成。
　　
　　特點(diǎn)：是目前zui直接與靈敏之步驟，亦是用來(lái)評估其它偵測新步驟之標準步驟。
　　
　　缺點(diǎn)：培養時(shí)間長(cháng)，須3－5星期才能判斷。有些支原體不能在培養基培養出來(lái)(例如M.hyorhinis)。需同時(shí)培養支原體株作為正反應對照組，可能會(huì )造成污染。
　　
　　材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無(wú)菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無(wú)菌培養皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培養箱、厭氧缸（厭氧缸長(cháng)期培養易有污染，所以厭氧包應用無(wú)菌水，每次打開(kāi)厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內壁。）
　　
　　污染是細胞培養的大敵，預防和避免污染是成功培養細胞的關(guān)鍵之一。危機意識要貫徹實(shí)驗的始終，否則不僅浪費時(shí)間，而且浪費人力、物力，甚至造成無(wú)法彌補的損失。
　　
　　支原體PCR檢測方法與結果：
　　
　　1，將已檢測出有支原體污染的細胞以正常傳代密度鋪到6孔板中，一個(gè)孔加清除劑，作為測試孔，另一孔不加清除劑，作為陰性對照孔。兩孔之間間隔一個(gè)孔，以免互相污染。
　　
　　2，在清除支原體的過(guò)程中細胞以常規方法傳代培養，并使細胞在培養過(guò)程中一直處于清除劑的作用下。在加清除劑后第4、8、9、11天各取1毫升培養上清。每份上清與細胞已共培養48小時(shí)，除第9天的上清只共培養了24小時(shí)。
　　
　　3，將這些培養上清在16000g離心5分鐘，小心去除離心上清，將沉淀用無(wú)菌PBS洗三次，每次以16000g離心5分鐘。zui后獲得的沉淀用100微升純水重懸，在100℃水浴中孵育5分鐘，然后用于PCR反應。
　　
　　4，按照支原體檢測試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR檢測操作，結果如下：
　　
　　4.1，與對照樣品共同反應，用這種方式可以判斷是否出現了假陰性結果。在加清除劑后第4天的樣品中仍可見(jiàn)到支原體陽(yáng)性條帶（約440bp），在第8、9、11天的樣品中，已看不到支原體陽(yáng)性條帶。
　　
　　4.2，不加對照樣品，檢測樣品單獨反應，用這種方式可以提高測試靈敏度?？梢?jiàn)在第8天和第9天的樣品中，支原體陽(yáng)性條帶仍然出現，但是弱于第4天的樣品。在第11天的樣品中，有明顯的200bp以下的非特異的條帶，且亮度高于陽(yáng)性條帶，所以判斷此時(shí)的PCR產(chǎn)物是非特異反應的產(chǎn)物，樣品中已沒(méi)有支原體DNA。