問(wèn):在用qEP做支原體檢測的時(shí)候,加入內控對照品,在儀器設置上是需要選擇兩個(gè)通道嗎?
答:是需要2個(gè)通道,一個(gè)FAM, 一個(gè)HEX,HEX是對應內控的通道。
問(wèn):我想問(wèn)一下,7500儀器里面沒(méi)有HEX這個(gè)通道選項,可以用哪個(gè)通道代替呢?
答:7500這款是沒(méi)有HEX熒光標識,不過(guò)問(wèn)過(guò)廠(chǎng)家,說(shuō)7500有VIC,可以用VIC通道。
問(wèn):qPCR結果判定中,FAM positive,HEX irrelevant中這個(gè)不相關(guān)是具體指什么?
答:這個(gè)不相關(guān)是指如果FAM是陽(yáng)性,那么由于擴增時(shí)存在競爭性抑制,所以?xún)瓤厥欠裼袛U增,其無(wú)關(guān)緊要。
問(wèn):在用樣品制備試劑盒時(shí),進(jìn)行支原體DNA提取時(shí),加入內控對照品,實(shí)際上是監控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA,而無(wú)法監測這步操作的回收率的,是嗎?
答:“實(shí)際上是監控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA”,可以這么理解,或者說(shuō)是在監測整個(gè)提取過(guò)程。我們又問(wèn)了一下廠(chǎng)家,內控和樣品的提取效率是一樣的,這樣可以反映樣品的真實(shí)情況,因為只要內控提取后能測出來(lái),那就表明提取是沒(méi)有問(wèn)題的。極少量的支原體如10CFU的,通過(guò)提取,也是可以檢測到的,表明靈敏度是沒(méi)有問(wèn)題的。樣本Ct值和10CFU的Ct值比較,是可以進(jìn)行相對定量的。
問(wèn):你們好,我問(wèn)一下你們這個(gè)Venor Gem qEP試劑盒能做放行檢測嗎?
答:放行應相當于國外說(shuō)的release testing, 這個(gè)qEP試劑盒是符合國外藥典規定的性能,能做放行檢測的。同時(shí)需注意要做支原體DNA抽提才行,抽提是用另外一個(gè)盒子,見(jiàn)廠(chǎng)家的venor gem sample preparation kit。
問(wèn):這個(gè)如果是用來(lái)檢測細胞上清,是不是就不用提取DNA了呢?
答:只要是跟藥典有關(guān),跟臨床治療或制藥檢驗有關(guān),就需要提取DNA。如果僅僅是科研用培養細胞,篩查支原體,則可以不提。
問(wèn):詢(xún)問(wèn)qPCR儀器的設置
答:具體可見(jiàn)MB廠(chǎng)家文件Venor®GeM qEP: Cyclers Programming,可從網(wǎng)站上下載。
問(wèn):被動(dòng)參比染料是選“none”吧?
答:對,沒(méi)有ROX,選none
問(wèn):大家好,想咨詢(xún)一下,咱們支原體DNA提取時(shí)所取的樣本量是依據什么定的呢,比如,我們有CAR-T細胞,病毒液等,如果CAR-T細胞按細胞數來(lái)的話(huà)取多少細胞數比較好,或者如果病毒液按體積的話(huà)多少體積更佳呢?
答:支原體 DNA 提取試劑盒可從多含有 1X 106細胞/ml 的細胞上清中直接分離 DNA,病毒沒(méi)有要求??傮w積多 200μl。提取的樣本就是細胞上清,ATMPs(高級醫用藥品),細胞培養基等。病毒液應該也是初來(lái)自細胞上清吧。樣本量是根據支原體污染量得出的經(jīng)驗值,跟核酸純化柱上的DNA膜吸附能力有關(guān)。
問(wèn):病毒液就是類(lèi)似細胞上清的。如果體積大于200ul的話(huà)我們可以濃縮,但是這個(gè)體積有沒(méi)有一個(gè)上限呢?
答:體積有上限,是200 to 1000 µl, 可以參看經(jīng)典法試劑盒的那個(gè)說(shuō)明書(shū)里對樣本處理那一塊。這個(gè)樣本量同時(shí)還考慮了靈敏度,使檢測達到很好的靈敏度。如果細胞數高于1X 106細胞/ml ,那必須要先調細胞數了?;蛘邷p少樣本體積,總細胞數不超,也行。
問(wèn):您好,我這邊要提取10cfu對照品的基因組,10cfu對照品的說(shuō)明書(shū)寫(xiě)著(zhù)用1ml基質(zhì)重懸,基因提取試劑盒說(shuō)一次上樣200μl進(jìn)行提取,想問(wèn)您一下,用200μl基質(zhì)重懸10cfu可以嗎,想一次提完。
答:還是建議用1ml的基質(zhì)重懸,因為靈敏度是以10CFU/ml為單位的。如果用200ul,濃度就高了。廠(chǎng)家建議10CFU標準品復溶了以后,要立即用完,不要再保存,擔心可能降解。
問(wèn):那1ml溶解的標準品,按提取試劑盒的要求,就得用多個(gè)管子一次提完對吧?
答:是的。
問(wèn):這個(gè)抽提試劑盒的收率有多少,是磁珠還是吸附柱?吸附柱的收率能有,因為以前我們用其他品牌的抽提試劑盒,收率只有百分之六,這樣的話(huà),就存在假陰性結果的可能。
答:是吸附柱的方法。提取試劑盒的COA里,用的是很少量的支原體10CFU/ml,提取DNA后都可以檢測到。廠(chǎng)家來(lái)信說(shuō),產(chǎn)率依賴(lài)于DNA的類(lèi)型(如GC含量,是基因組還是質(zhì)粒)、操作者的技巧以及樣本基質(zhì)的情況。因為這些情況,操作者很難達到生產(chǎn)商所給的比率,從而形成各種討論,因此產(chǎn)率沒(méi)寫(xiě)到說(shuō)明書(shū)里。
問(wèn):要檢測支原體的培養基中有酚紅,是否還需要抽提?
答:只要是在25ulPCR體系中加入的樣本量≤2ul,酚紅就不會(huì )對qPCR構成問(wèn)題。更高濃度的酚紅會(huì )引起基線(xiàn)偏移,造成靈敏度降低。如果僅僅是篩查,則不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的產(chǎn)品放行檢查,則需要抽提了。細胞基質(zhì)的驗證總是要做的。
問(wèn):做qPCR,一個(gè)陰性對照Ct約為40,也有擴增曲線(xiàn)。是什么原因?
答:Ct值大于40可能是由于產(chǎn)生非特異性信號(如primer artefacts)以及極微小的污染所致。 但是,該結果是不具有可重復性的,因此結果仍然是陰性。
問(wèn):一步法的盒子的靈敏度是否總低于經(jīng)典法試劑盒?有沒(méi)有可能一步法的盒子也能檢測10CFU?
答:廠(chǎng)家回復如下:意思是一步法的樣本量為2ul用于支原體篩查,經(jīng)典法為10ul,用于產(chǎn)品的放行檢測。檢測10CFU的標準品非常具有挑戰性。一步法因為樣本量不夠,很難達到10CFU/ml。如果客戶(hù)想要包含DNA聚合酶的PCR試劑盒,可以選擇VenorGeM Classic G型試劑盒。它和經(jīng)典法(不含酶)的交叉驗證確實(shí)做過(guò),顯示同樣的靈敏度。但全套的驗證沒(méi)有做過(guò)。
問(wèn):支原體10cfu標準品是干粉吧? 配完后是多少體積?
答:是凍干粉,加基質(zhì)液后是1ML體積。
問(wèn):基質(zhì)液產(chǎn)品里帶嗎?
答:這個(gè)產(chǎn)品里不帶,是客戶(hù)自己要檢測哪類(lèi)樣品,就用樣品里的基質(zhì)液(例如用的哪個(gè)培養基)
問(wèn):PCR經(jīng)典法,跑膠時(shí)體現1條陽(yáng)性帶,是否代表PCR經(jīng)典法可以檢測多種支原體,無(wú)法區分支原體種類(lèi)。
答:PCR經(jīng)典法,跑膠時(shí)為1條陽(yáng)性帶,無(wú)法區分支原體種類(lèi),需要將擴增產(chǎn)物測序鑒定。