隨著(zhù)分子生物學(xué)的發(fā)展,核酸編輯、擴增、測序、鑒定等以核酸為中心的技術(shù)變得越來(lái)越先進(jìn)和方便,尤其是單細胞RNA測序、數字PCR和轉基因技術(shù)的出現,使得核酸技術(shù)應用越來(lái)越廣泛,靈敏度也越來(lái)越高。
但同時(shí)也產(chǎn)生一些弊端,主要是:
1)PCR實(shí)驗造成DNA大量合成,不可避免地給實(shí)驗室帶來(lái)核酸污染。由于核酸產(chǎn)物不能自動(dòng)降解,因此只會(huì )不斷積聚;
2)由于靈敏度升高,少量污染的DNA或RNA分子也會(huì )被檢測出來(lái),從而造成實(shí)驗偏差。
3)核酸污染也給實(shí)驗人員帶來(lái)未知的健康風(fēng)險。
而傳統的紫外照射法對祛除DNA污染并不理想,因為它僅對500bp以上長(cháng)片段有效,對短片段效果不大。
那么,有沒(méi)有一種更好的方法呢?
Mynox® Gold 殺滅支原體 步驟詳解
Mynox® Gold含惟一的支原體殺除劑(而非抑制劑)Mynox®以及復合抗生素,用于祛除污染珍貴細胞或病毒種子批中的支原體和保種用。一個(gè)療程它由1管*治療液和3管主治療液,每管均為520μl即用型無(wú)菌溶液,2℃~8℃避光保存。*治療液可以殺滅大部分支原體,對細胞沒(méi)有毒害,主治療液殺滅所有剩余的支原體,實(shí)現**。
其操作示意圖如下:
實(shí)驗所需耗材:25cm2
細胞培養瓶或60 mm 培養皿
支原體消除結果評估:采用支原體檢測試劑盒如Venor® GeM系列。
具體操作步驟如下(超凈臺內操作):
1. 制備“*治療混合液”
1)吸量管吸取4.5ml含5%胎牛血清的細胞培養基,加入到無(wú)菌的15ml離心管中。再加入500 µl Mynox ® Gold*治療液(橘黃色蓋)。
2)將15ml離心管內的培養基和Mynox® Gold*治療液混勻。
3)將15ml離心管內的混合液(5ml)轉移至無(wú)菌的25cm2細胞培養瓶或60 mm 培養皿中。
2. 加入細胞
按細胞正常傳代來(lái)操作。對于貼壁細胞,使用胰酶將細胞解離打散。
1)注意:顯微鏡下觀(guān)察,確保為單細胞懸液,無(wú)細胞成團。
2)吸量管吸取5ml單細胞懸液(含104–105細胞,細胞培養基含5%胎牛血清),加入到上述的“*治療混合液”中。此時(shí)總體積為10ml。
注意:加入細胞時(shí),吸頭插入到液面下,以避免產(chǎn)生氣溶膠。吸頭不要觸及培養瓶/皿的內壁。
3)輕輕搖晃培養瓶/皿,以避免細胞分布不均。將細胞轉至孵箱正常培養。
3. 主要治療
1)細胞長(cháng)至80~90%匯合。
2)細胞正常傳代。取9.5ml已加新鮮培養基的細胞,加到無(wú)菌培養瓶或培養皿中。再加入500 µl Mynox® Gold主治療液(透明管蓋)。調整胎牛血清濃度,不再將其濃度保持在5%,可恢復正常濃度。
3)加入主治療液的細胞繼續培養,再重復以上步驟2次(采用Mynox® Gold主治療液 治療2次)。
第3次主治療液治療后,支原體即*去除(細胞總共傳了4代)
4. 支原體殘留的檢測
注意:支原體被Mynox®裂解后會(huì )釋放DNA到培養基中,此時(shí)檢測支原體會(huì )導致假陽(yáng)性。應再正常培養四代后檢測支原體。培養基更換和使用外源DNA酶可在1-2代內降低游離的支原體DNA。
建議采用高靈敏度的Venor ® GeM支原體檢測試劑盒檢查支原體。