牛血清是重要的細胞培養添加成分,具有終止胰蛋白酶消化,提供細胞生長(cháng)所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其他營(yíng)養物質(zhì)的作用。
根據采血時(shí)間的不同,牛血清通常分為:
胎牛血清(采自5-8月胎齡)
新生牛血清(采自出生0-7天內,也有說(shuō)法是0-30天內)
小牛血清(采自出生30天-1年)
成牛血清(采自成牛)
理論上,優(yōu)質(zhì)的胎牛血清在細胞培養方面通常優(yōu)于其他類(lèi)型的血清, 與新生牛和小牛血清相比,各類(lèi)生長(cháng)因子含量更為豐富,且由于5-8月胎牛沒(méi)有形成完整的補體系統,因此在使用的時(shí)候無(wú)需熱滅活。
但是由于胎牛血清價(jià)格相對而言會(huì )更高一些,不同實(shí)驗對于血清的需求也不同,因此,如何挑選適合自己實(shí)驗的血清就顯得尤為重要。總的原則就是,綜合考慮各實(shí)驗室、生產(chǎn)企業(yè)的條件與所培養細胞類(lèi)型。除了以往根據經(jīng)驗和文獻報道,必要時(shí)也可進(jìn)行針對特定細胞的血清篩選試驗,以篩選出最佳血清。
今天我們來(lái)分享一篇國內研究人員發(fā)表在《生物學(xué)雜志》上的標題為《不同類(lèi)型牛血清對MDCK細胞培養效果研究》的文獻,該研究對進(jìn)口胎牛血清、國產(chǎn)胎牛血清、國產(chǎn)新生牛血清在MDCK 細胞培養過(guò)程中的促生長(cháng)效果進(jìn)行了闡述。
研究方法
作者在含10%不同類(lèi)型牛血清的DMEM 培養液中連續傳代培養MDCK 細胞,比較了三種血清培養MDCK細胞的傳代穩定性、最大増殖密度、倍增時(shí)間、比生長(cháng)速率、貼壁率等指標。
1、貼壁培養傳代穩定性觀(guān)察
分別用含有10%A、B、C血清的DMEM培養基復蘇MDCK工作庫細胞,待細胞生長(cháng)至致密單層時(shí),分別用含有3種類(lèi)型血清的DMEM培養基培養并連續傳代10代,傳代時(shí)細胞均按照1∶6比例,置于5%CO2、37 ℃培養箱中。每代細胞在24和48 h拍照觀(guān)察細胞形態(tài)、長(cháng)勢及致密程度。
2、生長(cháng)曲線(xiàn)及生長(cháng)動(dòng)力學(xué)分析
取第4代3種類(lèi)型血清培養生長(cháng)狀態(tài)良好且鋪滿(mǎn)單層的MDCK細胞,計數稀釋至1×10^4 個(gè)/mL,接種于24孔細胞培養板,每孔接1 mL細胞懸液。將24孔細胞培養板放置5%CO2、37 ℃培養箱中進(jìn)行培養,每24 h消化3孔計數,計算平均值。按照此方法,對培養至第6代、第9代的MDCK細胞重復該試驗2次,計算3次平均值,繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。并比較3種類(lèi)型血清培養MDCK細胞的最大増殖密度、倍增時(shí)間、比生長(cháng)速率和平均比生長(cháng)速率。
3、貼壁率分析
取第4代、第6代和第9代3種類(lèi)型血清培養生長(cháng)狀態(tài)良好且鋪滿(mǎn)單層的MDCK細胞,按1.2.1所述方法將細胞稀釋至1×10^3個(gè)/mL,制成50 cells/4 mL的細胞懸液,在6孔細胞培養板中每孔加入4 mL的細胞懸液,并做平行3孔。將6孔細胞培養板放置5%CO2、37 ℃培養箱中培養8 d,出現集落后,用吸管吸去培養液,用PBS清洗,無(wú)水甲醇固定,結晶紫染色。觀(guān)察并對細胞集落計數,計算平均值。
4、細胞工廠(chǎng)擴大培養驗證
取第10代C血清培養生長(cháng)狀態(tài)良好且鋪滿(mǎn)單層的MDCK細胞,消化后計數,擴大培養至1層細胞工廠(chǎng)連續傳3代,加150 mL細胞培養液,接種密度為(8~9)×10^4 個(gè)/mL,置5%CO2、37 ℃培養箱,用上述方法,接種10層細胞工廠(chǎng),加1.5 L細胞培養液,接種密度為(8~9)×10^4個(gè)/mL,每12 h用細胞工廠(chǎng)觀(guān)察臺觀(guān)察,待細胞長(cháng)成致密單層后,繼續傳代培養3代,觀(guān)察細胞生長(cháng)情況并在長(cháng)成致密單層時(shí)消化計數。
實(shí)驗結果
在最大增殖密度和倍增時(shí)間上,胎牛血清均優(yōu)于新生牛血清。
在貼壁率方面[貼壁率(% ) = (所形成集落數/ 接種細胞數) ×100%],進(jìn)口胎牛血清略高于國產(chǎn)胎牛血清,差異顯著(zhù);國產(chǎn)新生牛血清低于國產(chǎn)和進(jìn)口胎牛血清,差異極顯著(zhù)。
總結
對于生產(chǎn)或研究所用的培養細胞,大多數情況下,生產(chǎn)或研究人員可以依據以往經(jīng)驗以及文獻報道選擇合適的血清。在個(gè)別不確定的情況下,也可參考以上文章的方法進(jìn)行最適血清的篩選。
參考文獻:
[1]李自良,王家敏,趙彩紅,王美皓,李倬,喬自林,馬忠仁.不同類(lèi)型牛血清對MDCK細胞培養效果研究[J].生物學(xué)雜志,2020,37(04):21-25.
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