細胞培養的本質(zhì)是細胞克隆技術(shù)。原理就是盡可能給細胞提供類(lèi)似于體內的環(huán)境,在無(wú)菌條件下,給予適當的溫度和酸堿度以及細胞生長(cháng)繁殖所必要的營(yíng)養條件,使其能在體外維持正常的生長(cháng)繁殖,并保持其結構和功能的技術(shù)。
細胞培養技術(shù)的應用十分廣泛,基礎醫學(xué)研究,抗體制備,新藥篩選,基因工程等等都需要用到細胞培養技術(shù)。
但在日常的細胞實(shí)驗中,實(shí)驗者經(jīng)常會(huì )遇到一些問(wèn)題,今天我們就這些常見(jiàn)的問(wèn)題給出相應的建議,希望對小伙伴們有所幫助。
貼壁細胞如何高效傳代?
貼壁生長(cháng)的細胞,在培養瓶或者培養皿長(cháng)至單層鋪滿(mǎn)的狀態(tài)后后,空間已基本上飽和,細胞生長(cháng)、增殖受阻,為使其繼續擴增或生長(cháng),需要進(jìn)行傳代(再培養)處理。同時(shí),傳代培養也可用于細胞種的保存。不僅如此,各種細胞實(shí)驗也是以高效的細胞傳代為基礎的。
懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞則需經(jīng)消化等處理后才能分瓶。
一般使用胰蛋白酶,將貼壁細胞消化成成單個(gè)細胞,也可加入EDTA提高消化能力(EDTA 是一種二價(jià)離子的螯合劑,能抑制細胞膜上的Ca2+和Mg2+)。
常用的細胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA。
實(shí)驗時(shí),先用吸去細胞培養上清,用PBS清洗細胞,棄掉洗滌液,重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(根據培養皿的大小不同,一般2-5ml消化液即可,以剛好鋪滿(mǎn)整個(gè)皿底為原則),觀(guān)察細胞直到細胞變圓脫離瓶壁,此過(guò)程一般需要3-5分鐘,為了避免細胞成團,消化細胞的過(guò)程中不要拍打細胞瓶。對于特別難消化的細胞,可以加入胰酶EDTA 消化液后把細胞置于37°C 促進(jìn)消化,細胞脫離瓶壁后,立刻加入含有血清的*培養基中止消化。
800-1000rpm,離心5分鐘,然后棄去中止用的培養基,加入適合的新的培養基輕輕混勻細胞,移入到新的培養瓶。傳代的比例視細胞類(lèi)型而定。胰蛋白酶會(huì )對某些細胞的細胞膜產(chǎn)生損傷,對于這種類(lèi)型的細胞,可用細胞刮輕輕刮下細胞,加入適量的培養基,輕輕吹打混勻細胞,然后進(jìn)行傳代培養。
細胞傳代的頻率為多久?
貼壁型的細胞的匯合度約為100%的時(shí)候,需進(jìn)行傳代操作。
當細胞以克隆的形式生長(cháng)時(shí),匯合度則達不到100%。對于該類(lèi)型的細胞,達到或者接近最大密度的時(shí)候,即觀(guān)察不到細胞明顯擴增時(shí),就需要進(jìn)行傳代。
接觸抑制型細胞需要在細胞長(cháng)滿(mǎn)之前傳代,避免產(chǎn)生細胞長(cháng)滿(mǎn)后接觸抑制后產(chǎn)生性狀的改變。
懸浮型的細胞必須在細胞達到最大飽和密度之前傳代,懸浮細胞傳代時(shí)只需稀釋至合適的密度,讓細胞有充足的營(yíng)養恢復到對數生長(cháng)期。
如何處理腫瘤細胞株?
了解每株細胞可能產(chǎn)生的生物危害是很難的。
強烈推薦,所有的人類(lèi)和其他靈長(cháng)類(lèi)生物的細胞在預防HIV和肝炎病毒的實(shí)驗條件下操作;
所有的操作必須在生物安全柜中操作,遵守生物安全柜使用規范;
操作過(guò)程中產(chǎn)生的廢液和廢儀器都要經(jīng)過(guò)清洗、酸處理等處理后才能丟棄。