干細胞是一類(lèi)具有無(wú)限的或者永生的自我更新能力的細胞、能夠產(chǎn)生至少一種類(lèi)型的、高度分化的子代細胞[1]。
干細胞被認為可以提供一種理想的生物學(xué)平臺, 用于多方面的科學(xué)研究與臨床應用, 如藥物篩選平臺的建立、細胞發(fā)育與分化的分子調節機制研究、基因靶向敲除動(dòng)物模型的構建、組織工程種子細胞及基因治療載體的建立、細胞治療及再生醫學(xué)等[2]。
干細胞研究離不開(kāi)干細胞的培養。合格的干細胞培養的過(guò)程,包括促進(jìn)其分裂增殖和維持其未分化狀態(tài)。
基于以上兩點(diǎn)要求,目前主流的標準培養方法為飼養層培養法:
即在有絲分裂失活的飼養層細胞 (FEEDER) 上培養干細胞。培養體系一般為高糖DMEM,添加適量的胎牛血清 (FCS) 及白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺等添加劑。
另外,為了避免外源性物質(zhì)的干擾(如血清、病原等成分)[3],又嘗試及建立了其他培養基, 包括條件培養基 (CM) 、無(wú)飼養層、無(wú)血清、血清替代物 (SR) 非條件培養基等。
其中無(wú)血清培養基中添加了更多珍貴的細胞因子,而血清替代物培養基則采用人工/半人工合成分子替代物的形式,來(lái)替代血清,成本相較于普通胎牛血清*培養基而言,高出不少。
01
飼養層培養法
目前認為,飼養層能夠提供干細胞接觸所必需的復雜蛋白分子。自1981年EVANS等人[4]用飼養層成功培養了mESC起,飼養層培養法便開(kāi)始不斷發(fā)展。實(shí)驗過(guò)程,主要分為以下三步:配制飼養層細胞培養基、準備飼養層細胞、配制飼養單層細胞培養基、飼養單層制備、配制干細胞培養基、接種干細胞培養。
飼養層培養法卻存在著(zhù)不可避免的缺點(diǎn):
1、 飼養層細胞生命期有限,不能在體外長(cháng)期傳代。在體外傳代時(shí)間太長(cháng),其產(chǎn)生促增殖因子和抑制分化因子的能力會(huì )減弱甚至喪失。
2、 MEF細胞的染色體干擾:飼養層細胞會(huì )影響干細胞遺傳物質(zhì)?!?/p>
3、 絲lie霉素-C的影響:飼養層細胞需要用到絲lie霉素-C,該物質(zhì)可能會(huì )影響干細胞的增殖。
4、 異種抗原及污染的影響:飼養層細胞作為異種抗原也會(huì )影響干細胞的健康,還有發(fā)生細胞間融、引入其他動(dòng)物源性病原體,給臨床移植治療帶來(lái)風(fēng)險。
5、 所用試劑復雜,批次不可控:所用材料的批次之間的波動(dòng),限制了培養物之間的可重復性。
6、 實(shí)驗周期長(cháng),培養基配制復雜:在基礎培養基的基礎上,添加例如白血病抑制因子(LIF)[6]這樣的多功能細胞因子,但無(wú)論進(jìn)口還是國產(chǎn)的產(chǎn)品,都不免有價(jià)格高昂的缺點(diǎn)。而自己配制,又會(huì )面臨操作繁瑣、易污染等問(wèn)題。飼養層培養從培養飼養細胞開(kāi)始,至少需要一周時(shí)間才能得到所需的干細胞,周期過(guò)長(cháng)。
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02
無(wú)飼養層培養
無(wú)飼養層培養類(lèi)似普通細胞培養,主要分為以下幾個(gè)步驟:培養瓶預處理、配制培養基、消化/復蘇干細胞、接種、培養。
相較于飼養層培養法,無(wú)飼養層培養法的優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn):更加簡(jiǎn)便、節省時(shí)間;但缺點(diǎn)也十分明顯:
1、 培養的細胞質(zhì)量不穩定:由于自行配制的培養基,不可控因素較多,缺少營(yíng)養細胞對的存在,干細胞生長(cháng)狀況也不穩定,直接影響實(shí)驗結果。
2、 成本高昂:商品化的培養基,根據品質(zhì)不同,價(jià)格也是從幾百元到幾千元不等,直接增加了干細胞的培養成本。
3、 需要不斷對培養基進(jìn)行調整,對實(shí)驗人員有很高的要求:無(wú)飼養層培養法需要人為添加各種各樣的細胞因子,不同的干細胞還需要進(jìn)行細微的調整以適應不同的生長(cháng)需求,因此培養難度更高,對技術(shù)人員的操作水平及經(jīng)驗有很高的要求