一、產(chǎn)品用途:
RT-PCR引物/探針(英文名:SARS-CoV-2 Confirm),用于定性檢測和分析新guan病毒RNA。它僅用于研究,不用于臨床診斷。
二、產(chǎn)品描述:
1.該產(chǎn)品包括三個(gè)小管:
①橙蓋: Mix(凍干粉),1管。
此管為新guan病毒引物/探針,可特異性擴增新guan病毒的RdRp基因(即RNA依賴(lài)性RNA聚合酶基因),而其他冠狀病毒RNA不會(huì )被檢測到【1】【2】。(該引物/探針依據WHO診斷參考實(shí)驗室公布的新guan病毒引物/探針序列而設計【1】。更多詳情可訪(fǎng)問(wèn)
如要檢測其他冠狀病毒,推薦MB公司提供的其他冠狀病毒引物/探針,品名:CoV Screen (without ConviFlex™ RT-Taq Mix),貨號:271-1100。
②綠蓋: Positive Control RNA(陽(yáng)性對照RNA,凍干粉),1管。
此陽(yáng)性對照RNA為一段合成的RNA序列(序列來(lái)自武漢的病毒株)。
③白蓋: PCR Grade Water(液體),1管。
2.使用前,①橙蓋和②綠蓋先用PCR級水(③白蓋)復溶,并分裝,避免反復凍融。
3.該引物/探針應與MB公司提供的【RNA病毒檢測試劑盒】(英文名:ConviFlex™RT-Taq Mix,
貨號192-0025/-0100/-0250)一起使用,用于新guan病毒RT-qPCR反應檢測。
4.檢測樣本需為抽提過(guò)的RNA樣本。
5.新guan病毒的靶基因RdRp是用FAM™通道檢測,擴增的人RNA酶P基因(過(guò)程對照)用ROX™通道檢測,用以評估樣本的制備質(zhì)量。
三、產(chǎn)品特點(diǎn):
1.靶點(diǎn)特別。依據WHO國際標準,此引物探針為新guan病毒RdRp基因,而非市面上常見(jiàn)的ORF1ab和N基因或E基因。
2.陽(yáng)性對照RNA為一段合成的RNA序列(序列來(lái)自武漢的病毒株)。
3.主要組分為凍干粉,4℃保存,儲存運輸方便,性能穩定。
4.適用于科研中,各種來(lái)源的RNA樣本,包括拭子、活檢組織、哺乳動(dòng)物細胞和細菌等。
四、需用戶(hù)自己準備的試劑耗材和儀器:
1.RNA病毒檢測試劑盒(RT-qPCR法)(英文名:ConviFlex™ RT-Taq Mix,貨號192-0025/-0100/-0250)
2.熒光定量PCR儀(qPCR儀)
3.無(wú)DNase和RNase的qPCR反應管
4.離心機
5.移液器及帶濾芯吸頭(不含DNase和RNase)
6.用戶(hù)自己提取的RNA或現成的RNA樣品。(抽提過(guò)程建議使用商品化的RNA提取試劑盒完成,如MB廠(chǎng)家的:
【病毒RNA提取試劑盒】(ExtractNow™ Virus RNA Kit,貨號611-1010/-1050/-1250)
或【病毒RNA拭子提取試劑盒】(ExtractNow™ Virus RNA Swab Kit,貨號611-2250)。
五、操作注意事項:
該引物/探針應僅由經(jīng)過(guò)培訓的實(shí)驗室人員使用。
始終穿上合適的防護服和戴一次性手套。
根據樣品類(lèi)型,應謹慎處理所有樣品。請遵循WHO推薦的方法處理樣本。
該試劑盒不含有害物質(zhì)。 殘余物可以根據當地法規丟棄。
六、操作步驟:
步驟1. 試劑制備
①橙蓋Mix引物探針凍干粉,最大速離心5秒鐘,加入525lPCR級水(白蓋),室溫靜置5分鐘后,渦旋并離心5秒鐘,分裝,待用或-18℃保存。
②綠蓋Positive Control RNA陽(yáng)性對照凍干粉,最大速離心5秒鐘,加入105lPCR級水(白蓋),室溫靜置5分鐘后,渦旋并離心5秒鐘,分裝,待用或-18℃保存。
步驟2. RT-qPCR引物/探針mix制備(20μl反應體積)
(1)1個(gè)反應需要加入:酶預混液 (自備的紅蓋預混液)10l ,
橙蓋(復溶的Mix引物/探針)5l
(紅蓋預混液 來(lái)自MB公司的【RNA病毒檢測試劑盒】(RT-qPCR法),
英文名:ConviFlexRT-Taq Mix, 貨號192-0025/-0100/-0250,需單獨購買(mǎi))
(2)將以上引物/探針mix渦旋混勻,并離心5秒鐘。
(3)每個(gè)PCR管中加入15μl上述引物/探針mix和5μl樣本(抽提后的RNA),
或5μl RNA提取試劑盒中的洗脫緩沖液,作為陰性對照,或5μl PCR級水作為無(wú)模板對照,或5μl陽(yáng)性對照RNA。
(4)緊扣PCR管,然后短暫離心。
(5)將PCR管放置qPCR儀上,緊上頂蓋。
步驟3. 設置qPCR程序
1個(gè)循環(huán): 55 ℃,10分鐘
1個(gè)循環(huán): 94 ℃,3 分鐘
45個(gè)循環(huán):94 ℃,15秒
58℃,30秒
步驟4. 啟動(dòng)程序
七、使用注意事項:
1.使用前應認真閱讀說(shuō)明書(shū)。
2.來(lái)自不同批次的試劑不能混合。
3.試劑盒內的試劑應始終作為一個(gè)整體溶解分裝。
4.試劑盒應在效期內使用。
5.每次PCR至少應設置一個(gè)陽(yáng)性對照。每次PCR至少應設置一個(gè)陰性對照和/或一個(gè)無(wú)模板對照。如果實(shí)驗者自己抽提RNA,則可使用洗脫緩沖液作為陰性對照。對照必須與待測樣品的處理方式相同。您也可能需要其他實(shí)驗室提供的對照品,例如含高、中、低不同濃度的RNA樣品。使用對照,對于確認結果的可靠性或用于排除故障非常有意義。
6.建議在無(wú)RNA和DNA污染的條件下進(jìn)行RT-PCR,以避免操作過(guò)程中DNA或非特異RNA的交叉污染。(MB公司推薦使用PCR污染祛除噴霧,英文名:PCR Clean™,貨號15-2025,預先清潔實(shí)驗環(huán)境。)
7.盡量減少RNA樣品的凍融次數,同時(shí)避免RNA酶污染,以減少RNA降解的風(fēng)險。(RNA降解會(huì )極大地限制了RT-qPCR反應的性能)。請確保高質(zhì)量的完整RNA用于檢測。
8.樣本制備過(guò)程中,注意避免其他DNA的污染,DNA的干擾也會(huì )降低qPCR的準確性。