細胞凍存
細胞凍存是細胞實(shí)驗中的一個(gè)常規步驟,是細胞保存的重要方法之一。將細胞低溫保存在-196℃液氮中,使細胞暫時(shí)脫離生長(cháng)狀態(tài)而進(jìn)入休眠階段,以便日后復蘇重新培養擴增。
細胞凍存方法
細胞凍存實(shí)驗,在往期文章中也有提到
保姆級細胞凍存方法
看似簡(jiǎn)單的實(shí)驗,仍有一些關(guān)鍵點(diǎn)需要格外留意,切莫踩到“雷區",造成“實(shí)驗大翻車(chē)"。
凍存操作前:
選擇長(cháng)勢良好、存活率高,且生長(cháng)密度在80%—90%的細胞進(jìn)行凍存。
需對細胞進(jìn)行雜質(zhì)檢測:是否有雜細胞或者支原體等雜質(zhì)。
這里推薦使用MB支原體常規法PCR檢測試劑盒,非定量檢測,常規PCR即可滿(mǎn)足需求,方便快捷,靈敏度高。
所用凍存試劑DMSO應為分析級,避光儲存。
凍存前一日,對需保存的細胞進(jìn)行換液處理。
凍存操作
配制凍存培養基(常規含量):DMSO含量5-10%,血清含量20%左右。
用凍存培養基將離心后的細胞進(jìn)行重懸。
分裝至無(wú)菌凍存管中。
梯度降溫:
4℃ 10 分鐘
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-20℃ 30 分鐘
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-80℃ 16~18 小時(shí)
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液氮
或將裝有細胞的凍存管,置于程序降溫盒中,放入-80℃冰箱中,一天后轉移至液氮中。
液氮的液相儲存與氣相儲存
一般認為:-196℃的液氮,對于需要長(cháng)期保存的細胞而言,是一比較合適的環(huán)境。因此,我們會(huì )將裝有細胞的凍存管,放入專(zhuān)用的方形凍存盒中,再裝進(jìn)液氮罐配套的提籃提籃中,浸入液氮的液相中進(jìn)行保存。
但在液相中長(cháng)期儲存,容易面臨以下問(wèn)題:
如果凍存管在罐內密封不嚴,則會(huì )引起液氮滲入管內,灌滿(mǎn)整個(gè)樣品管,造成樣品的污染。不僅如此,在取出凍存管的時(shí)候,液氮沸騰氣化使管內氣壓升高,發(fā)生炸裂,容易傷到實(shí)驗人員。
因此,有人提出,可以將細胞置于液氮的氣相中進(jìn)行儲存。
液氮罐內溫度較比液相儲存高,一般在-135℃至-190℃,對于細胞儲存而言,該溫度也符合要求,但在實(shí)際操作過(guò)程中,也存在一定弊端:
與液相液氮罐相比,氣相液氮罐,在相同體積的液氮中保存時(shí)間更短,需對液氮罐內的溫度進(jìn)行監控,及時(shí)補充液氮來(lái)維持罐內溫度。
所以,應根據實(shí)驗環(huán)境、實(shí)驗條件等情況,合理選擇液相儲存或是氣相儲存。在正確操作的前提下,這兩者都能達到比較好的凍存效果