我國藥典中規定,新生牛血清是從出生14小時(shí)內未進(jìn)食的新生牛采血分離血清,經(jīng)除菌過(guò)濾后制成。牛血清生產(chǎn)過(guò)程中不得任意添加其他物質(zhì)成分。新生牛血清應進(jìn)行以下檢查,符合規定后方可使用。
如釆用經(jīng)過(guò)驗證的病毒滅活工藝處理的牛血清,大腸埃希菌噬菌體及病毒檢測必須在滅活前取樣進(jìn)行。
pH值:應為7.00~8.50。
蛋白質(zhì)含量:采用雙縮脲法(通則0731第三法)或其他適宜方法測定,應為35~50g/L。
血紅蛋白:用分光光度法或其他適宜的方法測定,應不高于200mg/L。
滲透壓摩爾濃度:應為250~330mOsmol/kg(通則0632)。
細菌內毒素檢查:應不高于10EU/ml(通則1143凝膠限度試驗)。
支持細胞增殖檢查:采用傳代細胞(HFL1、Mv1 Lu、Vero和CHO)中的任意1種細胞及Sp2/0-Ag14細胞進(jìn)行。細胞復蘇后,用待測樣品配制的培養液至少連續傳3代后使用,取對數生長(cháng)期的細胞用于試驗。
(1)細胞生長(cháng)曲線(xiàn)的測定 取供試品按10%濃度配制細胞培養液,Sp2/0-Ag14按每1ml含1×10^4的細胞濃度,其他貼壁細胞按2×104的細胞濃度接種細胞,每天計數活細胞,連續觀(guān)察1周,并繪制生長(cháng)曲線(xiàn)。
(2)細胞倍增時(shí)間的測定 按生長(cháng)曲線(xiàn)計算細胞的倍增時(shí)間。取細胞峰值前一天的細胞計數(Y)、接種細胞數(X)及生長(cháng)時(shí)間(T)計算。
Sp2/0-Ag14細胞應不超過(guò)20小時(shí);HFL1細胞應不超過(guò)22小時(shí);Mv1 Lu細胞應不超過(guò)24小時(shí);Vero細胞應不超過(guò)18小時(shí);CHO細胞應不超過(guò)22小時(shí)。
(3)克隆率的測定 將細胞稀釋至每1ml含10個(gè)活細胞的濃度,按每孔1個(gè)細胞接種于96孔細胞培養板,每板至少接種60孔,于37℃、5%二氧化碳培養,定期觀(guān)察細胞克隆生長(cháng)情況,培養1周后計數每孔中的細胞克隆數,并計算克隆率,應不低于70%。
無(wú)菌檢查:依法則檢查(通則1101),應符合規定。
支原體檢查:依法則檢查(通則3301),應符合規定。
大腸埃希菌噬菌體:采用噬斑法和增殖法檢測。不得有噬菌體污染。
病毒檢查:
(1)樣品制備 取約250ml的新生牛血清供試品用于檢測,將其配制成含15%供試品的培養液,用于檢測全過(guò)程的細胞換液及傳代,以檢測合格的血清作為陰性對照血清。
(2)指示細胞制備 至少采用猴源(如Vero細胞)、2種牛源細胞(BT和MDBK細胞或無(wú)病毒污染的原代牛腎細胞)以及人二倍體細胞作為指示細胞,細胞復蘇后至少傳代1次后使用,根據所需量制備足夠量的細胞。
(3)用含有供試品的培養液將4種指示細胞分別接種于75cm2細胞培養瓶中,接種量應使細胞在培養7天后可達到至少80%~90%匯合。同時(shí)制備陰性對照血清培養瓶。將培養瓶置37℃、5%CO2培養箱中培養至少7天??稍诘?span>5天時(shí)換液一次。
(4)第7天進(jìn)行第1次盲傳,將接種供試品及陰性對照的每種指示細胞培養瓶分別傳出至少2個(gè)75cm2培養瓶,繼續培養至第14天,在第12天時(shí)可換液一次。
(5)在第13天時(shí)(或第2次傳代前1天)或陰性對照瓶細胞達到至少70%匯合時(shí),制備陽(yáng)性對照用細胞。即取1個(gè)陰性對照細胞瓶分別傳至6孔板或其他適宜的細胞板中用于細胞病變觀(guān)察(CPE)、血吸附檢查(HAd)及熒光抗體檢測(IF),次日接種陽(yáng)性對照病毒。
(6)第14天時(shí)進(jìn)行第2次盲傳。將第1次傳代后的細胞培養物分別傳至6孔板或其他適宜的細胞板中,進(jìn)行細胞病變觀(guān)察及HAd檢查時(shí),接種于每種指示細胞上的待測樣本至少接種3孔;進(jìn)行熒光抗體檢測時(shí),接種于每種指示細胞上的待測樣本進(jìn)行每種病毒檢測時(shí)至少接種2孔。繼續培養至少至第21天,剩余細胞樣本-60℃或以下保存備用。
(7)在第14天接種陽(yáng)性對照病毒:?。?span>5)制備的指示細胞接種適量陽(yáng)性對照病毒,置36℃±1℃、5%CO2培養箱吸附2小時(shí),吸棄上清液,加入適量細胞維持液,置36℃±1℃、5%CO2培養箱培養7天,對于BT細胞,BVDV可作為病變陽(yáng)性對照,BPI3可作為HAd陽(yáng)性對照,牛副流感病毒3型(PI3)、牛腺病毒(BAV-3)、牛細小病毒(BPV)以及牛腹瀉病毒(BVDV)可作為IF檢測陽(yáng)性對照;對于MDBK細胞,呼腸孤病毒3型(REO3)和PI3可分別作為細胞病變及HAd檢查陽(yáng)性對照,PI3、BAV-3、BVDV、REO-3為IF檢測陽(yáng)性對照;對于Vero細胞,Pl3可作為細胞病變及HAd檢查陽(yáng)性對照,PI3及REO-3作為IF檢測陽(yáng)性對照??刹辉O立狂犬病病毒(Rabies)陽(yáng)性對照。所有IF檢測陽(yáng)性對照病毒應接種100~300CCID50。
(8)接種陰性對照及供試品的細胞培養物在接種后每日觀(guān)察細胞病變情況,在接種后至少21天或末次傳代后至少7天時(shí)分別進(jìn)行病變觀(guān)察、HAd檢查及IF檢測,陽(yáng)性對照培養物在接種后第7天或10%細胞出現CPE時(shí)可進(jìn)行IF檢測。
進(jìn)行血吸附檢查時(shí),用雞與豚鼠血紅細胞在2~8℃及20~25℃進(jìn)行檢測。
進(jìn)行熒光抗體檢測時(shí),將細胞固定后采用直接或間接免疫熒光抗體檢查法,至少應對BVDV、PI3、BAV-3、BPV、REO3以及 Rabies進(jìn)行檢查,結果均應為陰性。
(9)結果判定 陰性對照應無(wú)細胞病變,血吸附檢查應為陰性,熒光抗體檢測應為陰性;陽(yáng)性對照應有明顯的細胞病變,血吸附檢查應為陽(yáng)性,熒光抗體檢測應為陽(yáng)性,判為試驗成立。供試品如無(wú)細胞病變,血吸附檢查為陰性,且熒光抗體檢測為陰性,判定為符合要求。待測樣本如出現細胞病變,或血吸附檢查為陽(yáng)性,或任何一種熒光抗體為陽(yáng)性,則判定為不符合要求。
經(jīng)病毒滅活處理的牛血清,滅活前取樣檢測后若任何一項檢測顯示為陽(yáng)性,不建議用于生產(chǎn)。除非可鑒別出污染的病毒,且病毒滅活工藝驗證研究顯示其污染量可被有效滅活時(shí)方可使用,如果滅活前BVDV病毒檢測為陽(yáng)性,滅活后還應取樣采用敏感的方法檢測BVDV,結果陰性為符合要求。
未經(jīng)病毒滅活處理的牛血清若任何一項檢測顯示為陽(yáng)性,則不得用于生產(chǎn)。
不能用感染試驗檢測的牛源性病毒可采用核酸檢測法,但應采用較大量的樣品提取核酸(如25~50ml的血清樣本),并計算合并血清的檢測限。