干細胞的培養需要胎牛血清提供營(yíng)養成分。Ausbian進(jìn)口胎牛血清,澳洲血源內毒素含量低,品質(zhì)穩定。
哺乳動(dòng)物囊胚內細胞群(inner cell mass, ICM)的瞬時(shí)多能狀態(tài),可以在體外,通過(guò)建立胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)或體細胞重編程為誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)來(lái)獲得。
通過(guò)這些方法可以產(chǎn)生可擴展的PSC系,根據培養條件的不同,來(lái)模擬不同的早期胚胎階段。植入前的icm樣PSCs通常被稱(chēng)為“naive",而植入后的上皮細胞樣PSCs被稱(chēng)為“primed"。 naive多能性的黃金標準是產(chǎn)生,具有同源psc來(lái)源細胞的高貢獻的活嵌合動(dòng)物,這種方法已經(jīng)在小鼠和大鼠中得到了很好的建立。
從原始psc中產(chǎn)生高貢獻的嵌合非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物(NHPs),將有力地證實(shí)在進(jìn)化上與人類(lèi)接近的物種中植入前的icm樣多能性。
無(wú)論是通過(guò)早期胚胎注射CRISPR-Cas9試劑,還是通過(guò)培養成纖維細胞基因編輯結合體細胞核移植,對nhps進(jìn)行復雜的基因修飾,其效率都受到限制。另一種方法是利用同源psc產(chǎn)生高貢獻嵌合。然而,NHPs和其他哺乳動(dòng)物的嵌合現象落后于嚙齒動(dòng)物。先前的研究表明,NHP與同源PSCs嵌合產(chǎn)生的流產(chǎn)胎兒或食蟹猴后代的嵌合組織供體細胞貢獻較低(0.1-4.5%)。
通常認為,不能實(shí)現大量嵌合是由于供體細胞與宿主胚胎缺乏發(fā)育匹配,供體細胞在囊胚或組織壁龕中逐漸競爭性消除所致。
最近的研究表明,通過(guò)過(guò)度表達外源因子(如BCL2或BMI1)來(lái)操縱生存途徑部分克服PSC凋亡并增強種間嵌合,具有誘導基因組異常的風(fēng)險。因此,改進(jìn)培養程序以達到更忠實(shí)的primed多能狀態(tài)是一種合適的實(shí)驗方法。目前有多種培養基可用于誘導人類(lèi)naive多能干細胞,這些培養基在naive多能基因的表達水平和基因組穩定性方面存在差異目前已知,誘導primed多能基因高表達的配方顯示出較低的全球dna甲基化水平,從而導致基因組不穩定和核型異常這種異??赡苡绊懽⑸涞?span>psc的分化潛能。值得注意的是,最近報道的4CL培養基能夠產(chǎn)生具有高表達水平的primed多能基因的人類(lèi)原始psc,并且在長(cháng)時(shí)間培養中沒(méi)有可檢測到的核型異常
近日,發(fā)表在《Cell》上的一篇研究,系統測試了多種人PSC培養基對食蟹猴ESCs的影響,并優(yōu)化了早期猴胚胎的注射方案和注射胚胎的體外培養。
文章標題為:“Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells"。
科研人員發(fā)現,4CL可使猴供體PSCs在同源囊胚內的存活改善猴初始多能狀態(tài),并且建立了一個(gè)完整的組織表征管道,包括GFP+細胞計數,線(xiàn)粒體和基因組DNA的單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析,以及單細胞轉錄組分析。使用這些方法,研究人員證明了猴ESCs在體外長(cháng)時(shí)間胚胎培養和體內妊娠期間的高度嵌合,產(chǎn)生的后代在嵌合組織(包括性腺和胎盤(pán))中顯示了20-90%的供體ESCs。該結果代表了一個(gè)原則性的證明,即通過(guò)與同源的原始PSCs的早期胚胎互補,可以在NHPs中產(chǎn)生具有高ESC貢獻的嵌合體,為未來(lái)一代基因編輯的PSCs的轉基因NHPs鋪平了道路。