葉酸測定用培養基的原理

正常人的血清葉酸水平正常為9.9ng / ml。在身體異?；虻貌r(shí)，葉酸水平會(huì )顯著(zhù)變化。葉酸干酪培養基采用干酪乳桿菌（ATCC 7469）為測定用菌，用于葉酸的微生物法測定。該培養基是基于Flynn等人(1)的配方，并經(jīng)Baker等人(2)和Waters、Mollin(3)改良。用于維生素測定的測定菌通常需要三種培養基：維持培養基、接種培養基和測定用培養基。后者通常是化學(xué)限定的培養基，包含所有測定菌生長(cháng)所需的養分，但不含有待測的分子。類(lèi)似的，葉酸干酪培養基包含干酪乳桿菌生長(cháng)所需的所有成分，但不包含葉酸。因而，添加一系列濃度增加的葉酸，會(huì )觀(guān)察到干酪乳桿菌生長(cháng)反應的遞增。

干酪乳桿菌（ATCC 7469）的貯備菌制備是在A(yíng)OAC推薦的乳桿菌瓊脂（貨號M366）試管穿刺接種培養，35-37°C孵育18-24小時(shí)后，試管儲存在冰箱里。每月轉接一次。測定菌液的制備是將貯備菌轉種到含10ml微量維生素檢測接種肉湯（貨號M133）或乳酸桿菌肉湯（貨號M367）的試管中。35-37°C孵育24小時(shí)后，在無(wú)菌條件下菌液離心，棄掉上清，再重懸于10ml的無(wú)菌葉酸干酪培養基中（貨號M543）。再像之前一樣沉淀，并清洗一次。zui后，清洗后的菌株重懸于10ml葉酸干酪培養基中，并用該培養基進(jìn)行1:100稀釋。1滴重懸液用于接種到每個(gè)測定管中。也可用0.85% NaCl代替培養基來(lái)清洗和稀釋。

由于滅菌條件，孵育溫度等因素會(huì )影響標準曲線(xiàn)讀數，并且每次不會(huì )*一樣，因此每次都應制備標準曲線(xiàn)。10ml管內的標準品量為0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1ng。

葉酸標準品的制備：將20mg葉酸干粉溶于含有20ml乙醇的100ml蒸餾水中。用0.1N NaOH調整溶液pH值為10.0，再用0.05N HCl調pH為 7.0。該溶液含有200g葉酸/ml。用999ml蒸餾水稀釋1ml該溶液，則濃度為200ng/ml。再用999ml葉酸緩沖液A（貨號M544）稀釋1ml該溶液，則為0.2ng/ml的葉酸標準溶液。每管取0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0和5ml該溶液，配置即告完成。

血清樣本的保存：讓血液樣本凝固以分離血清。分離血清至干凈干燥的血清管，并離心除去存在的任何血細胞。小心操作，避免出現紅細胞的溶血。分裝血清樣本至于干凈干燥的試管中，每管5ml。每管加入25mg的抗壞血酸。-20°C以下溫度保存。

血清樣本的制備：解凍含有抗壞血酸的血清。向5ml樣品中加入45ml葉酸緩沖液A（M544）。孵育37℃90分鐘。然后15磅121℃高壓滅菌2.5分鐘。離心去除凝固的蛋白，將上清液轉移至清潔干燥的管中。該透明溶液即可用作葉酸待測的樣本。

樣本葉酸濃度的測定步驟：如前所述使用0.5,1.0,1.5ml或其他體積的制備好的血清提取物。加入5ml葉酸干酪培養基和足量的蒸餾水，使每個(gè)試管的總體積為10ml。15磅121°C滅菌5分鐘。冷卻試管并向每個(gè)試管中加入一滴接種液。35-37℃孵育18-24小時(shí)后進(jìn)行濁度讀數。讀數前將試管冷藏15-30分鐘以停止細菌生長(cháng)。620nm檢測吸光度。待測樣品中的葉酸含量應根據標準曲線(xiàn)來(lái)確定，不過(guò)要考慮樣品稀釋度。

應非常小心，避免培養基和玻璃器具被污染。應使用潔凈的無(wú)去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導致錯誤的結果。