在分子生物學(xué)領(lǐng)域中,準確測量DNA或RNA分子的數量是實(shí)驗的關(guān)鍵步驟。
傳統的PCR技術(shù)在這方面發(fā)揮了重要作用,但它存在著(zhù)一些局限性。為了解決傳統PCR技術(shù)的限制,并提高分子檢測的準確性和靈敏度,數字PCR(dPCR)應運而生。
本文將追溯dPCR的發(fā)展歷程,探討其在分子生物學(xué)研究中的重要性與相關(guān)應用。
dPCR技術(shù)的起源
一般認為,早期的數字PCR可以追溯到20世紀90年代,當時(shí)研究人員使用微小的PCR反應體積來(lái)檢測單個(gè)分子。這種方法被稱(chēng)為限制性酶消化PCR(RE-PCR),它使用限制性酶將DNA分子切成小片段,然后對這些小片段進(jìn)行PCR擴增。
在二十世紀末,研究人員開(kāi)始使用微流控技術(shù)來(lái)制造微小的反應體積。這種方法被稱(chēng)為微滴數字PCR(ddPCR),它可以將單個(gè)DNA分子分隔成數百萬(wàn)個(gè)微小的反應體積中。這種技術(shù)可以提高PCR反應的靈敏度和精確性,并且可以用于檢測罕見(jiàn)的突變和低拷貝數的DNA序列。
dPCR的原理與優(yōu)勢
dPCR是一種基于單分子級別的PCR擴增技術(shù)。與傳統的PCR相比,dPCR將反應混合物分割成更小的單元,使每個(gè)單元中只有一個(gè)分子。通過(guò)限定性稀釋?zhuān)梢源_定反應體系中的模板分子數。然后,利用熒光標記或探針技術(shù)檢測每個(gè)單元中是否存在目標序列,并計算目標分子的絕對數量。
dPCR的優(yōu)勢dPCR在許多方面優(yōu)于傳統PCR。首先,作為一種絕對定量的方法,dPCR能夠提供更高的靈敏度和準確性,尤其對于低豐度的目標分子。其次,由于每個(gè)單元都是獨立擴增和檢測的,因此dPCR對于抑制物的影響更小,結果更可靠。此外,dPCR還具有較寬的動(dòng)態(tài)范圍和更好的檢測限度,能夠檢測罕見(jiàn)突變和微小的拷貝數變化。
?dPCR的應用
dPCR已廣泛應用于宿主細胞DNA殘留檢測、基因表達分析、突變檢測、病原體檢測和液體活檢等領(lǐng)域。在基因表達研究中,dPCR能夠準確測量不同基因的表達水平,并發(fā)現低豐度的轉錄變異。在突變檢測中,dPCR能夠檢測罕見(jiàn)突變,對于腫瘤早期診斷和治療選擇具有重要意義。在病原體檢測方面,dPCR的高靈敏度和準確性使其成為檢測感染病原體的理想工具。在液體活檢中,dPCR可以通過(guò)檢測循環(huán)腫瘤DNA來(lái)監測腫瘤動(dòng)態(tài)變化,為腫瘤的診斷和治療提供重要依據。
未來(lái),dPCR可能會(huì )被更廣泛地應用于許多領(lǐng)域,包括醫學(xué)、生物學(xué)、環(huán)境科學(xué)和食品安全等。在醫學(xué)領(lǐng)域,dPCR可以用于檢測癌癥和其他疾病的DNA標記物,以及監測藥物治療的效果;在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域,dPCR可以用于檢測水和土壤中的微生物和污染物。在食品安全領(lǐng)域,dPCR可以用于檢測食品中的病原體和污染物。