400-166-8600
繼上回的準備篇和菌種篇，這回要真正測定了。在各個(gè)測定管孵育20小時(shí)以上獲得zui大濁度時(shí)，即可用渦旋振蕩器混勻，之后倒入1cm比色杯，在540nm處測定吸光度（OD值）。以未接種的對照管的OD值為0，依次測定標準管、樣本。如果對照管OD值＞0.1，或者標準管OD值變化＜40%，說(shuō)明有雜菌或葉酸混入，需重做。
測完OD值后，以葉酸含量為橫坐標，每個(gè)標準管OD均值為縱坐標，做標準曲線(xiàn)。根據樣本OD值和標準曲線(xiàn)，可以確定樣品對應的葉酸含量。關(guān)于標準曲線(xiàn)，有人發(fā)現OD值隨著(zhù)葉酸濃度增加而增長(cháng)趨緩, 略呈S形。若使用線(xiàn)性方法，數據點(diǎn)分布在曲線(xiàn)兩側，求得的葉酸濃度不準。建議使用EXCEL功能建立4階曲線(xiàn)方程，則曲線(xiàn)與實(shí)驗數據的擬合程度較好（1）。
圖1. 1階線(xiàn)性擬合
圖2. 4階線(xiàn)性擬合，優(yōu)于1階
采用直接提取法進(jìn)行的葉酸含量可按如下公式進(jìn)行計算。其前提是：每個(gè)樣品有2個(gè)管葉酸含量在0.10ng-0.80ng范圍內，且各管間偏差小于10%。
計算公式：
葉酸含量（g/100g）= (C*V*f)/m * 0.1
C為樣品稀釋液葉酸濃度(ng/ml)，V為提取液定容體積（ml），f為樣本提取液稀釋倍數，m為樣本質(zhì)量（g），0.1為ng/g換算為g/100g的系數。
以上就是相對完整的測定過(guò)程，不僅適合嬰兒配方食品，也適合谷薯、果蔬、豆及堅果類(lèi)食品，只不過(guò)樣品需要用酶解提取法。大致過(guò)程如下：準確稱(chēng)量適量試樣（0.2-2g葉酸），如堅果類(lèi)是0.2-2g，至0.0001g，轉入100ml錐形瓶中，加30mlPBS（含抗壞血酸作為葉酸保護劑），混勻5分鐘后高壓滅菌。再加1ml雞胰腺溶液。對于蛋白和淀粉含量豐富的樣本，應再加1ml蛋白酶和淀粉酶溶液。再加3至5滴甲苯后，37℃孵育16小時(shí)，再轉入100ml容量瓶，加水定容，過(guò)濾。
之所以采取酶解法，是因為在一些食品中葉酸以蛋白結合的形式存在，以上提取方法是依據中國預防科學(xué)院食品與衛生研究所對食品前提取方法進(jìn)行的研究(2)。該研究還發(fā)現，蔬菜樣品采用二次水解法效果比較好；葉酸在酸性和過(guò)堿性環(huán)境中破壞嚴重，因此樣品提取液和培養基pH值應控制在6.8-7.2。
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參考文獻
1. 唐靚，等.國標<食品中葉酸的測定>的標準曲線(xiàn)繪制與計算.中國衛生檢驗雜志. 2009,19(7):
2.王竹. 樣品前處理對食物中葉酸測定的影響.衛生研究. 2000, 29 (6):404-406
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